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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱仪的支持介质

2022-06-24 来源:沈阳农业机械网

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱仪的支持介质

聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱仪(简称聚丙烯酰胺凝胶电泳仪)的支持介质有原性凝胶和变性凝胶。原性凝胶是在凝胶中不加变性剂,蛋白质在这种凝胶中的迁移率受它们的静电荷和分子大小两个因素的影响,分子量不同,而带静电荷相同,可能迁移率相同。因此,在原性凝胶中进行电泳不能测定蛋白质分子量。变性凝胶是在凝胶中加入变性剂如尿素、十二烷基磺酸钠(SDS)、巯基乙醇和二硫苏糖醇等,可破坏或改变蛋白质的结构,把绝大部分蛋白质解离成亚基。同时,在蛋白质分子周围包围了大量负电荷,掩盖了无变性剂存在时就有的任何电荷。蛋白质在变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系,利用变性凝胶进行电泳可测定蛋白质分子量。目前应用较多的变性剂是SDS。一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:SDS是一种很强的阴离子表面活性剂,能破坏蛋白质分子间的结构,尤其是在强还原剂如巯基乙醇存在下使蛋白质分子内的二硫键还原打开,并以其疏水基与蛋白质分子的疏水区相结合,形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS复合物。在一定条件下,SDS与大多数蛋白质的质量结合比为1.4:1,所引入的净电荷大约为蛋白质本身净电荷的10倍,使其所带电荷远超过蛋白质原有的净电荷,从而清除或大大降低了不同蛋白质之间所带净电荷不同对迁移率的影响。SDS与蛋白质结合后还引起了蛋白质构象的改变。由蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状近似于雪茄烟形的长椭圆棒,不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样,约为1.8nm,而长轴与蛋白质的分子量成正比,消除了电泳过程中蛋白质分子形状对迁移率的影响。因此,蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响,而主要取决于蛋白质分子量大小。蛋白质分子的电泳迁移率与分子量的计算公式为:lgM = a-bRf式中:a为丙烯酰胺单体的质量,b为交联剂的质量,Rf = 蛋白质染色后的迁移距离/溴酚蓝在染色后迁移距离。测定时,通常选用已知分子量的标准蛋白质作为标记物,与分子量未知的待测蛋白质样品在同一条件下进行SDS-PAGE电泳,将已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率作横坐标,相应分子量的对数作纵坐标,绘制标准曲线,根据待测蛋白质样品的相对迁移率可在标准曲线上求得分子量。现在经SDS-PAGE电泳测定过的蛋白质已有一百多种,具有分辨率高、重复性好、设备简单、操作简便和快速等特点,已发展成为蛋白质研究的有力工具。在分子量为15000~20000范围内,与用其它方法相比,误差一般在±10%以内。二、用SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量时应注意的问题:1、如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS:1g蛋白质的比率,并具有相同的构象,不能得到有效的结果。影响蛋白质与SDS结合的主要因素有:(1)二硫键是否完整被还原:只有在蛋白质分子内的二硫键被有效还原的情况下,SDS才能定量地结合到蛋白质分子上,并具有相同的构象,一般以巯基乙醇作还原剂。有些情况下,还需进一步将形成的巯基烷基化,以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。(2)溶液中SDS的浓度:溶液中SDS的总量至少比蛋白质的量高3倍,一般高10倍以上。(3)溶液的离子强度:溶液的离子强度应较低,较高不能超过0.26。因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体存在,SDS结合到蛋白质分子上的量仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度,在低离子强度的溶液中,SDS单体具有较高的平衡浓度。2、不同的凝胶浓度适用于不同的分子范围:在浓度为5%、交联度为2.6%的凝胶中,分子量为25000~200000的蛋白质分子量的对数与迁移率成直线关系。在浓度为10%、交联度为2.6%的凝胶中,分子量为10000~70000的蛋白质分子量的对数与迁移率成直线关系。在浓度为15%、交联度为2.6%的凝胶中,分子量为10000~50000的蛋白质分子量的对数与迁移率成直线关系。浓度为3.33%、交联度为2.6%的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。可根据所测分子量范围选择较合适的凝胶浓度,并尽量选择分子量范围和与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率较好在0.2~0.8之间均匀分布。影响SDS-PAGE电泳迁移率的因素较多,而在制胶和电泳过程中,很难每次将各项条件都控制得完整一致。因此,用SDS-PAGE电泳测定分子量时,每次测定样品必须作标准曲线。3、有许多蛋白质由亚基或两条以上肽链组成,它们在SDS和巯基乙醇的作用下解离成亚基或单条肽链。对于这类蛋白质,SDS-PAGE电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量,而不是完整分子的分子量。为了得到更完整的数据,必须用其它方法测定其分子量和分子中肽链的数目等,与SDS-PAGE电泳的结果相互参照。4、不是所有蛋白质都能用SDS-PAGE电泳测定其分子量,已发现有些蛋白质用这种方法测定的分子量不可靠。这些蛋白质有电荷异常和构象异常的蛋白质、带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)、一些结构蛋白质(如胶原蛋白)等,因为尽管结合了正常比例的SDS,但仍不能完整掩盖其原有电荷的影响。对于这些蛋白质,至少要用两种方法来测定分子量,相互验证。

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